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蝦堿性磷酸酶使用注意事項(xiàng)

蝦堿性磷酸酶（Shrimp Alkaline Phosphatase,SAP)催化DNA和RNA 的5’和3’磷酸單脂的去磷酸化反應(yīng)，也可水解核糖和脫氧核糖核苷三磷酸（NTP 和 dNTP）。該酶在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用廣泛，如去除DNA和RNA 末端的磷酸基團(tuán)，用于后續(xù)的克隆和探針末端標(biāo)記。在克隆中，載體經(jīng)蝦堿性磷酸酶去磷酸化后5’ 端無磷酸基團(tuán)，因而不可以和自身3’ 端連接。蝦堿性磷酸酶可作用于5’突出端、凹陷端和平末端，也可用來降解PCR反應(yīng)中的游離dNTP，用于制備測序模板和SNP分析。該蝦堿性磷酸酶在65℃溫育5分鐘即可完-全的、不可逆的失活，因此，在連接或末端標(biāo)記之后，可以不用去除。基于以上特性，該酶是傳統(tǒng)去磷酸化酶--小牛腸堿性磷酸酶的替代物。

 應(yīng)用

 DNA 和 RNA 的去磷酸化

防止克隆載體的自連

制備5′末端標(biāo)記模板

去除 PCR 產(chǎn)物中的 dNTP 和焦磷酸鹽

 活性定義

 1單位指在25℃條件下，30分鐘能使1μg經(jīng) HindIII（產(chǎn)生5’突出末端）消化的 pUC19 DNA 去磷酸化所需的酶量。去磷酸化標(biāo)準(zhǔn)是指在自連接反應(yīng)中能抑制＞95%的DNA 再連接。

 使用注意事項(xiàng)

 （1）1×SAP Buffer：50 mM Bis-Tris HCl pH 6.0，1mM MgCl2，0.1 mM ZnCl2，25℃ 溫育。

（2）熱失活：65℃ 加熱 5 分鐘，不可逆失活。該酶通常用于酶切載體的去磷酸化，因其不可逆熱失活特性。當(dāng)完成去磷酸化反應(yīng)后，無需再純化產(chǎn)物，可以直接用于后續(xù)連接反應(yīng)。

（3）蝦堿性磷酸酶也可以用來降解PCR反應(yīng)中的游離dNTP，用于制備測序模板和 SNP 分析。同樣無需純化，可直接用于下游實(shí)驗(yàn)。